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血管生成實(shí)驗(yàn)步驟-實(shí)驗(yàn)方法完善版

更新時(shí)間:2018-06-28   點(diǎn)擊次數(shù):4887次

前言
      無(wú)論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤,一旦生長(zhǎng)直徑超過(guò)1~2 mm,都會(huì)有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長(zhǎng)因子,誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長(zhǎng)迅速。因此,血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用,抑制這一過(guò)程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實(shí)驗(yàn)就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過(guò)程,并且適合研究藥物對(duì)這一過(guò)程的影響實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以HUVEC細(xì)胞為例,介紹這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過(guò)程。

圖一  血管生成鏡檢圖

一.實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
 
1.實(shí)驗(yàn)材料

2.實(shí)驗(yàn)方法:
2.1實(shí)驗(yàn)流程介紹

圖二  實(shí)驗(yàn)流程圖

(提前將Matrigel融化,鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中,待膠凝后,將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中,成管后使用顯微鏡觀察。)

2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三   血管生成載玻片縱截面示意圖

(Matrigel鋪在下孔,細(xì)胞鋪在Matrigel上,上孔充滿培養(yǎng)基)

2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四  實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集和分析流程圖
(在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片,并且進(jìn)行圖像分析(Wimasis全自動(dòng)分析)測(cè)量小管長(zhǎng)度,成環(huán)數(shù),細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。)

一.實(shí)驗(yàn)步驟
1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠
1.實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4。C冰箱,使膠能guo夜緩慢融化。(注意:同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel)
2.開始實(shí)驗(yàn)前,將Matrigel始終保持放在冰盒中。
3.打開滅菌包裝,取出ibidi血管生成載玻片。
4.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng),并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能打入10μl的膠,卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel:
我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示,垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說(shuō)明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
 
2、凝膠
1.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2.準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過(guò)水的紙巾,制成一個(gè)濕盒。
3.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4.將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。
5.等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

3、鋪細(xì)胞
加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前,要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得*比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞,每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。
1.準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,充分混勻。
2.將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3.每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
4.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。
5.蓋上蓋,靜置,一段時(shí)間后,所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

4、采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像,并且對(duì)其成管長(zhǎng)度,覆蓋面積,成環(huán)數(shù),結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄,并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5、.免疫熒光染色
根據(jù)需要,可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。
小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
加入50μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
在室溫下避光孵育30分鐘。
使用PBS清洗三次,注意,PBS要緩緩加入上孔,以免沖擊掉細(xì)胞。
使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)
1.這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠,降低實(shí)驗(yàn)成本;
2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面,使成像效果更好。

(左側(cè)ibidi血管生成載玻片無(wú)凹液面,整個(gè)視野成像清晰;右側(cè)96孔板有凹液面,中間清晰周圍模糊。)

 

 

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